Применение количественной микроскопии к живым клеткам

Почему микроскопия исторически была качественной техникой и как достижения в области технологий сделали микроскопию количественной?

У микроскопии долгая история. Он был разработан около 350 лет назад для ученых, чтобы визуализировать то, что они могли различить, но не описать. Двумя пионерами микроскопии были Антуан ван Левенгук, который разработал первый микроскоп, а вскоре и известный ученый Роберт Гук.

Их микроскопы увеличивали образцы в 10-20 раз, что позволило им впервые визуализировать детали известных образцов, таких как вши, вблизи, но замечательным открытием стал микроскопический мир, о существовании которого они не подозревали.

Ван Левенгук ввел термин анималкулы, который обозначает то, что мы называем бактериями и другими простейшими в воде, о которых наука ничего не знала. С помощью этих ранних микроскопов они впервые смогли их визуализировать.

По сравнению с 350-летней историей микроскопии, это качественный метод. Исследователи и ученые хотели визуализировать микроскопические образцы и сообщать о том, что они видят.

Количественная микроскопия - совсем другое дело. Это стало возможным благодаря эпохе цифровых технологий и, в частности, благодаря возможности оцифровывать свет с помощью преобразователей, таких как устройства с заряженной связью или камеры CCD, которые в наши дни присутствуют почти в каждой цифровой камере.

Эти камеры позволяют захватывать изображения в цифровом формате, которые затем могут быть обработаны и проанализированы с помощью компьютерных программ для количественной оценки биологии в вашем изображении.

Как можно использовать количественную микроскопию для оценки внутриклеточной среды?

Есть множество способов провести количественную микроскопию. Очень распространенный способ проведения количественного эксперимента с помощью микроскопии - использование различных флуоресцентных зондов. Обычно это начинается с использования ядерной окраски. Это химические пятна с избирательностью по ДНК.

Почти вся ДНК ваших клеток находится в ядре, поэтому это химическое пятно будет преимущественно окрашивать ядро, позволяя идентифицировать ядра на вашем изображении. Предполагая, что одна клетка имеет одно ядро, это первое окрашивание позволяет идентифицировать и подсчитывать клетки на вашем изображении.

Затем можно использовать другие флуоресцентные зонды разных цветов для изучения клеточных структур и / или количественной оценки клеточной функции. Имеется широкий спектр коммерчески доступных флуоресцентных зондов. В качестве примеров мы можем использовать различные флуоресцентные зонды для количественной оценки потенциала митохондриальной мембраны, продукции активных форм кислорода или событий транслокации белков.

Последнее приложение использует каспазу-3, которая активируется апоптозом для перемещения из цитоплазмы в ядро. Мы также использовали микроскопию для количественной оценки транскрипции биомаркера рака РНК с помощью флуоресцентной гибридизации in situ. Существует так много возможностей для количественной микроскопии, потому что доступно множество различных зондов.

Какие преимущества дает количественная микроскопия перед традиционными микроскопами?

Количественная микроскопия позволяет проводить клеточную биологию, обеспечивая прямое количественное измерение клеточных процессов в реальном времени посредством обработки и анализа изображений.

Если рассматривать традиционный микроскоп как устройство, обладающее только качественными возможностями (без обработки или анализа изображений), то можно получить замечательные изображения, детализирующие клеточную структуру, но измерение клеточных функций в лучшем случае является полуколичественным. Цифровая визуализация и компьютерные возможности объединяются для обеспечения количественной микроскопии.

Пример полезности количественной микроскопии - открытие лекарств с использованием клеточной модели, выражающей фенотип, имитирующий конкретное заболевание. Этот фенотип может быть таким же простым, как способность линии раковых клеток к размножению.

Эффективные лекарства уменьшат или остановят пролиферацию этих клеток. Этот фенотип можно количественно оценить путем подсчета клеток в реальном времени с помощью микроскопии.

Это предоставит информацию о том, какие лекарства активны против фенотипа, ранжирует их способность подавлять фенотип, определит кинетику активных лекарств и количественно оценит фармакологию наиболее многообещающих лекарств.

Необходимы ли флуоресцентные метки или красители для количественной микроскопии?

Флуоресцентные зонды очень полезны для количественной микроскопии, и многие из них были разработаны как для анализа фиксированных, так и живых клеток. Методы без этикеток также могут использоваться для количественной микроскопии, что особенно полезно для визуализации живых клеток.

Несколько производителей микроскопов предлагает ряд методов для проведения количественной микроскопии без меток без использования флуоресцентных зондов. Канал светлого поля, который контролирует способность образца поглощать белый свет, является одной из форм микроскопии без этикеток. Мы использовали эту форму микроскопии для измерения% слияния клеток в лунке микропланшета и в анализах инвазии опухоли.